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    • 专利摘要:

    公开号:WO1980000615A1
    申请号:PCT/DE1979/000108
    申请日:1979-09-12
    公开日:1980-04-03
    发明作者:B Lammel
    申请人:B Lammel；
    IPC主号:G01N27-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen präparativen Trennung von Molekülen und ähnlichen Partikeln.
    [0002] Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Vorrichtungen zur kontinuierlichen präparativen Trennung von Molekülen und ähnlichen Partikeln und bezieht sich insbesondere auf ein Träger-Elektrophoreseverfahren sowie Vorrichtungen zu deren Durchführung.
    [0003] Die Trennung von Molekülen und anderen Partikeln, wie z. B. Zellen, ist in der Biologie und Chemie ein zentrales Problem, das insbesondere bei der Trennung von Proteinen auftritt. Bei solchen geladenen Teilchen kann zur Trennung die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit in einem elektrischen Feld ausgenutzt werden, was in Form der sogenannten präparativen oder analytischen Elektrophorese geschieht. Während bei der analytischen Elektrophorese die Proteine nur identifiziert werden sollen, wird bei der präparativen Elektrophorese mit den getrennten Teilchen weitergearbeitet. Es sind mehrere diskontinuierliche Elektrophoreseverfahren bekannt. Das einzige Elektrophoreseverfahren, das einen kontinuierlichen Betrieb erlaubt, ist derzeit das sogenannte kontinuierliche Freifluß- Elektrophoreseverfahren ("continuous free-flow-elektrophoresis") , wie es z. B. aus Chromatography Erich Heftmann, van Nostrand-Reinhold Company, 1975, oder von Seiler, N. , Thobe, J. , Werner, "G. Zeitschrift für analytische Chemie 252; 179-182, bekannt ist. Bei dieser Elektrophorese handelt es sich um eine sogenannte trägerfreie Elektrophorese, bei der ein Lösungsmittel zwischen zwei Glasplatten senkrecht zu einem elektrischen Feld fließt, wobei an beiden Seiten der Glasplatten Elektroden zur Er- zeugung des elektrischen Feldes angebracht sind. Als Teilchen werden z. B. Proteine in den Lösungsmittelstrom eingebracht, von diesem mitgeführt und je nach Ladung und Größe zu den Elektroden hingezogen, wodurch ihre Trennung erfolgt. Das Verfahren weist jedoch den wesentlichen Nachteil auf, daß das Lösungsmittel zwischen den Glasplatten über eine längere Strecke turbulenzfrei strömen muß. Da das elektrische Feld zwangsläufig zu einer erheblichen Wärmeerzeugung führt, ist die erforderliche Turbulenzfreiheit auch mit Hilfe eines aufwendigen Kühlungssystemes nur bedingt erzielbar. Da ferner die durch das elektrische Feld erreichbare Teilchentrennung der elektrischen Feldstärke und damit der Wärmeentwicklung proportional ist, muß ein Kompromiß zwischen Strömungsstrecke und elektrischer Feldstärke bzw. zwischen Teilchen-Trennleistung und Kühlaufwand gefunden werden, von dem der Wirkungsgrad der Anordnung bestimmt ist. Zwar treten bei der sogenannten Träger-Elektrophorese (electrophoresis of proteins in polyacrylamid and starch gels, A.H. Gordon, North-Holland Publishing Company, 1974) die vorstehend erläuterten Probleme in einem wesentlich geringerem Maße auf, da sich die zu trennenden Teilchen hierbei in einem meist aus einem Gel bestehenden Trägermedium bewegen, in dem kaum Turbulenzen auftreten können. Die Träger-Elektrophorese weist jedoch den grundlegenden Nachteil auf, daß kein kontinuierlicher Betrieb möglich ist, was zur Folge hat, daß stets nur eine bestimmte diskontinuierliche Probemenge getrennt werden kann. Falls die Teilchen einer präparativen Verwendung zugeführt werden sollen, müssen sie darüberhinaus bei diesem meist zur Analyse von Teilchengemischen verwendeten Verfahren wieder nach Zerschneiden des Gels aus diesem entfernt werden, was mit erheblichem Aufwand verbunden ist. Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine kontinuierliche Elektrophorese mit turbulenzfreier Teilchentrennung ohne das Erfordernis eines erheblichen Kühlaufwandes zu ermöglichen.
    [0004] Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein das Lösungsmittel mit den zu trennenden Partikeln aufnehmendes Festkörper-Trägermedium kontinuierlieh in dem elektrischen Feld transportiert wird.
    [0005] Erfindungsgemäß werden somit die insbesondere in Turbulenzen und dem Erfordernis eines hohen Kühlaufwandes bestehenden Nachteile der trägerfreien Elektrophorese vermieden und der in Turbulenzfreiheit bestehende wesentliche Vorteil, der Träger-Elektrophorese zur Erzielung einer kontinuierlichen präparativen Träger-Elektrophorese ausgenutzt.
    [0006] In Bezug auf die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen hierbei die Möglichkeiten, daß das Festkörper-Trägermedium auf einem senkrecht zu den Feldlinien eines homogenen elektrischen Feldes bewegten Endlos-Transportband oder einem als Scheibe ausgebildeten und in einem homogenen oder inhomogenen Feld rotierenden Drehteller angeordnet ist, oder daß das Festkörper-Trägermedium als in einem elektrischen Feld rotierender Zylinder ausgebildet ist.
    [0007] Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen wiedergegeben.
    [0008] Ausführungsformen von Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Zeichnungen dargestellt und werden nachstehend näher beschrieben. Es zeigen:
    [0009] Fig.1 eine Seitenansicht einer ersten Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Elektrophoreseverfahrens,
    [0010] Fig.2 eine Draufsicht der Vorrichtung gemäß Fig.1,
    [0011] Fig.3 eine Draufsicht einer modifizierten Ausführungsform der Vorrichtung gemäß Fig. 2,
    [0012] Fig.4 eine Seitenansicht einer zweiten Ausführungs form der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Elektrophoreseverfahrens,
    [0013] Fig.5 eine Vorderansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 4,
    [0014] Fig.6 eine Draufsicht der Vorrichtung gemäß Fig.4, bzw. Fig. 5,
    [0015] Fig.7 eine Draufsicht einer modifizierten Ausführungsform der Vorrichtung gemäß Fig. 4, bzw. Fig. 5,
    [0016] Fig.8 eine Draufsicht einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung gemäß Fig. 7,
    [0017] Fig.9 eine schematische Darstellung zur Veranschaulichung Von Teilchen-Bahnkurven bei den Vorrichtungen-gemäß den Fig. 4-7,
    [0018] Fig.10 eine Schnittansicht einer dritten Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des er findungsgemäßen Elektrophoreseverfahrens, Fig.11 eine Draufsicht der Vorrichtung gemäß Fig. 10.
    [0019] In Fig. 1 ist eine erste Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Elektrophoreseverfahrens dargestellt. Die Vorrichtung gemäß Fig. 1 besteht aus einem unendlichen Band aus einem Trägermedium (1) (z. B. einem Gel). Das Trägermedium wird nach innen von einem Förderband (2) und nach außen von einem Gehäuse (3) gehalten. Das Förderband (2) wird innen gestützt. Rollen (4) sind mit einem Motor verbunden, der das Förderband (2) und damit das Trägermedium bewegt. Hierzu muß das Förderband (2) einen größeren Reibungswiderstand als das Gehäuse (3) aufweisen. Elektroden (5) (Fig. 1, 2, 3) sind seitlich des Trägermediums (1) in jeweils einer Elektrodenkammer angeordnet. Die zu trennenden Teilchen, z. B. Moleküle, befinden sich in einem Behälter (6) (Fig. 1, 2, 3) in Lösung. Die Lösung durchtränkt das Trägermedium ( 1 ) und befindet sich ebenfalls in den beiden Kammern für die Elektroden. Für die Einbringung der Moleküle in den Träger kommen nun zwei Methoden in Betracht:
    [0020] 1. Es wird ein zusätzliches elektrisches Feld verwendet, wozu im Behälter (6) eine zusätzliche Elektrode angebracht wird, während die andere Elektrode in einem Rohr (7) angeordnet ist.
    [0021] 2. Es wird eine Pumpe verwendet, die Flüssigkeit aus dem Rohr (7) herauspumpt und die gleiche Flüssigkeit wieder in den Behälter (6) einspeist.
    [0022] Die Teilchen bewegen sich nun mit dem umlaufenden Trägermedium und werden gleichzeitig je nach Größe u. Ladung zu den Elektroden (5) gezogen. Nach der Trennung der Moleküle bestehen auch wieder zwei Möglichkeiten für ihre Entfernung aus dem Trägermedium.
    [0023] 1. Die Moleküle können an den Seiten vor den Elektroden (5) (Fig. 2) in vielen kleinen Behältern (8) (Fig.2) aufgefangen werden. Diese Behälter sind zu der positiven Elektrode gemäß Fig. 2 hin offen. (Hier wird der Fall behandelt, daß die zu trennenden Teilchen negativ geladen sind. Bei positiv geladenen Teilchen müssen die Elektroden umgepolt werden.) Die Moleküle werden dann mittels einer Membran (9) (Fig. 2) von der Elektrode getrennt. Diese Membran soll die zu trennenden Teilchen zurückhalten, das Lösungsmittel jedoch durchlassen. In den Behältern (8) werden die Teilchen sodann konzentriert und können beliebig entnommen werden. Dabei muß jedoch das entnommene Volumen durch frisches Lösungsmittel ersetzt werden.
    [0024] 2. Die Teilchen bzw. Moleküle werden auf der der Einspeisung gegenüberliegenden Seite von Behältern (10) (Fig. 3) aufgefangen. Auch hier gibt es wieder zwei Möglichkeiten für die Entfernung der Teilchen aus dem Trägermedium und deren Ansammlung in den Behältern (10).
    [0025] a) Durch eine Pumpe kann ein Strom des Lösungsmitte zwischen den Rohren (11) und (12) (Fig.1, 3) erzeugt werden. Mit die'sem Strom werden die Teil chen mitgeführt. Die Behälter (10) sind wiederu durch eine Membran von dem Rohr (12) getrennt. Die Membran hält die Teilchen zurück und läßt das Lösungsmittel hindurchtreten, wodurch die Teilchen in den Behältern (10) angereichert werden. Das Rohr (11) ist in Richtung zu den Behäl tern (10) hin offen. Es kann oberhalb oder unterhalb des Förderbandes (2) liegen. Liegt es unterhalb, so muß das Förderband (2) für das Lösungsmittel durchlässig sein. Diese (Elutions-) Vorrichtung kann vorwiegend bei Trägern verwandt werden, die für Flüssigkeit gut durchlässig sind.
    [0026] b) Die Teilchen werden durch ein elektrisches Feld aus dem Träger entfernt. Die hierzu erforderlichen Elektroden liegen in den Rohren (11) und (12).
    [0027] Die Auffangvorrichtung und die Einspeisung müssen nicht am Ende oder Anfang der Vorrichtung angeordnet sein, sondern können sich .parallel verschoben an einer beliebigen Stelle, jedoch möglichst weit voneinander entfernt, befinden.
    [0028] In den Fig. 4 bis 9 ist eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Elektrophoreseverfahrens dargestellt. Bei dieser Ausführungsform wird das Trägermedium im elektrischen Feld gedreht. Das Trägermedium (1) (Fig. 4, 5, 6, 7, 8) liegt hierbei auf einem Drehteller (22) (Fig. 4,5), der von einem Motor (23) angetrieben wird. Die gelösten zu trennenden Teilchen befinden sich in einem Behälter (25). Sie werden mit Hilfe eines elektrischen Feldes oder mit eindr Pumpe zentral oder ein wenig außerhalb des Zeritrums des Trägermediums eingebracht. Werden die Teilchen mit einer Pumpe eingebracht, dann ist die Welle zum Motor als Hohlwelle ausgebildet, deren Bohrung (24) zu einer Pumpe führt. Werden die Teilchen durch ein elektrisches Feld eingebracht, so ist im Behälter (25) (Fig. 4, 5) eine Elektrode angeordnet. Die zugehörige zweite Elektrode befindet sich dann in einem Schlauch, der als Steigleitung bis auf das Flüssigkeitsniveau des Behälters (25) gezogen wird. Hierbei muß der Drehteller (22) zumindest im Zentrum porös sein. Die Teilchen folgen dann der Rotationsbewegung des Trägermediums und werden gleichzeitig zu den Elektroden (26) (Fig. 6,7) hingezogen. Die Elektroden und das Trägermedium befinden sich hierbei in dem Lösungsmittel der zu trennenden Teilchen. Für die Bahnkurve der Teilchen gilt bei zentraler Einbringung folgende Differentialgleichung:
    [0029] X = - ω y + Vχ ω= Winkelgeschwindigkeit der Rotation
    [0030] Y = ω x Vχ = die durch das elektr.
    [0031] Feld hervorgerufene Geschwindigkeit der Teilchen
    [0032] Die Lösungen dieser Gleichungen sind. für verschiedene Teilchensorten in Fig. 9 dargestellt.
    [0033] Auch hier bestehen wiederum zwei Möglichkeiten für die Entfernung der getrennten Teilchen aus dem Trägermedium:
    [0034] 1. Die Teilchen können tangential zur Trägerscheibe bzw. dem Drehteller (22) in vielen Behältern (27) (Fig. 7) gesammelt werden. Die Behälter sind zur Trägerscheibe bzw. zum Drehteller (22) hin offen und werden in Richtung der Elektroden durch eine Membran begrenzt. Die Teilchen werden in diesen Behältern gesammelt und können kontinuierlich entnommen werden.
    [0035] 2. Die Teilchen können senkrecht zur TrägerScheibe durch viele Behälter (28) (Fig. 6, 4, 5) entnommen werden, was durch ein zusätzliches elektrisches Feld erfolgen kann. Die eine zugehörige Elektrode ist hierbei in einem Behälter (29) (Fig. 4) angeordnet, der von Behältern (28) durch eine Membran abgetrennt ist. Die Membran ist durchlässig für Lösungsmittel und hält die zu trennenden Teilchen zurück. Die andere Elektrode befindet sich in einem Steigrohr (21), das sich unterhalb des porösen Drehtellers (22) befindet. Die Teilchen können auch durch eine Pumpe aus dem Trägermedium in die Auffangbehälter gepumpt werden. Dazu ist eine Peristaltikpumpe geeignet, die zwischen dem Steigrohr (21) und dem Behälter (29) angeordnet ist. Die Einspeisung der Teilchen muß nicht im Zentrum des Trägermediums (1) (Fig. 4, 5) erfolgen, sondern kann an einer beliebigen Stelle geschehen.
    [0036] Die Entnahme der getrennten Teilchen wird zweckmäßig mittels einer Peristaltikpumpe durchgeführt, die Flüssigkeit aus den Behältern (28) entnimmt und gleichzeitig Lösungsmittel in sie einspeist. Ähnlich kann die Zuführung neuen Materials erfolgen. Das Frischmaterial wird dann am Boden des Behälters (25) eingespeist und Lösungsmittel in der Nähe der Oberfläche entnommen. Dabei können Einspeisungs- und Entnahmestelle durch eine Membran getrennt werden. Die Rohre (12) (Fig. 4, 5, 6, 7) sind Steigleitungen für Blasen, die sich an den Elektroden bilden.
    [0037] Eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung gemäß
    [0038] Fig. 7 ist in Abbildung 8 dargestellt. Hier wird ein elektrisches Zentralfeld durch die Punktelektrode (8') und den Draht (9') gebildet, wobei für die Feldstärke gilt:
    [0039] Die Teilchen werden über den Behälter (5') eingespeist und wandern in Richtung der Elektrode (8'). Durch die Drehung des Trägermediums (1) werden sie getrennt und gelangen sodann in die Behälter (7'). In den Fig. 10 und 11 ist eine dritte Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Elektrophoreseverfahrens dargestellt. Bei dieser Ausführungsform ist das Trägermedium als Hohlzylinder (31) geformt. Die zu trennenden Teilchen sind zunächst in dem Behälter (32) in Lösung. An die Elektroden (33) und (34) wird elektrische Spannung angelegt, wodurch die Teilchen in das Trägermedium (31) hineingezogen werden. Nun wird das als Hohlzylinder ausgebildete Trägermedium mit konstanter Winkelgeschwindigkeit in Drehung ver setzt. Die Teilchen bewegen sich dann je nach Größe und Ladung in einem raumfesten Koordinatensystem auf Spiralen mit verschiedener Steigung und können in den Behältern (35) getrennt aufgefangen werden. Die Behälter (35) sind zur Elektrode (34) hin durch eine Membran getrennt, die die getrennten Teilchen zurückhält und das Lösungsmittel durchläßt. Stangen (36) dienen hierbei als Halterung. Eine Steigleitung (37) dient zur Ableitung von Blasen, die an der Elektrode (34) entstehen. Der Flüssigkeitsspiegel reicht bis auf das.Niveau im Behälter (32). Durch Verdickung, Ausbeulung oder Verengung des Trägermediums können zusätzlich noch Feldgradienten aufgebracht werden. Außerdem können noch Dichte- oder pH-Gradienten im Träger aufgebracht werden. Diese Maßnahmen dienen zur Fokussierung der Teilchen und können bei sämtlichen vorstehend beschriebenen Ausführungsformen Anwendung finden.
    [0040] Um eine Diffusion der Teilchen senkrecht zu den Feldlinien zu vermeiden, können in der dritten und ersten Anordnung parallel zu den elektrischen Feldlinien Trennwände in das Trägermedium eingebaut werden, die die zu trennenden Teilchen zurückhalten. Außerdem kannstatt das elektrisches Feldes in allen Ausführungen durch ein beliebiges anderes Kraftfeld ersetzt werd
    权利要求:
    Claims P a t e n t a n s p r ü c h e
    1. Verfahren zur kontinuierlichen präparativen Trennung von Molekülen und ähnlichen Partikeln, bei dem sich die Partikel mit einem in einem elektrischen Feld transportierten Lösungsmittel mitbewegen und je nach
    Ladung und Größe mit unterschiedlicher Geschwindigkejt in Richtung der Feldlinien gezogen und entsprechend getrennt werden, dadurch gekennzeichnet, daß ein das Lösungsmittel mit den zu trennenden Partikeln aufnehmendes Festkörper-Trägermedium kontinuierlich in dem elektrischen Feld relativ zu der Zuführungs- bzw. der Sammelvorrichtung der zu trennenden Partikeln bewegt wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Festkörper-Trägermedium ein Gel ist.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Festkörper-Trägermedium senkrecht zu den Feldlinien eines homogenen elektrischen Feldes bewegt wird.
    4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Festkörper-Trägermedium in einem homogenen elektrischen Feld rotiert.
    5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Festkörper-Trägermedium in einem inhomogenen elektrischen Fe.ld rotiert.
    6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrische Feld ein Zentralfeld ist.
    7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrische Feld zylindrisch ist.
    8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Festkörper- Trägermedium (1) auf einem senkrecht zu den Feldlinien eines homogenen elektrischen Feldes bewegten Endlos- Transportband (2) angeordnet ist.
    9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Festkörper- Trägermedium (1) auf einem als Scheibe ausgebildeten und in einem homogenen Feld rotierenden Drehteller (22) angeordnet ist.
    10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der als Scheibe ausgebildete Drehteller. (22) in einem inhomogenen elektrischen Feld rotiert.
    11. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspru 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Festkörper-Trägermedium (1) als in einem elektrischen Feld rotierender Zylinder (31) ausgebildet ist.
    12. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß nicht ein elektrisches Feld benutzt wird, sondern irgendein Kraftfeld, wie z. B. das Gravitationsfeld.
    13. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermedium kein Festkörper ist, sondern eine viskose Flüssigkeit.
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    引用文献:
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    法律状态:
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    1980-04-03| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): FR |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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